Πλήρης Ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος WES και WGS

WES και WGS μέσω NGS –  Η Αλληλούχιση Επόμενης Γενιάς για την Διάγνωση Σπάνιων Κληρονομούμενων Νοσημάτων

Εν έτει 2025, η “χρυσή” (gold standard) μέθοδος για να ξεκινήσει η διερεύνηση ενός σπάνιου νοσήματος, είναι η πλήρης ανάλυση γονιδιώματος είτε μέσω WES (Whole Exome Sequencing / Ανάλυση των εξονίων του γονιδιώματος – 100X) ή σπανιότερα μέσω WGS (Whole Genome Sequencing / Ανάλυση των εξονίων και εσονίων του γονιδιώματος – 30X). Τεχνικά, οι παραπάνω αναλύσεις διεξάγονται μέσω της τεχνολογίας αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS).

Η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διάφορα επίπεδα πολυπλοκότητας. Αυτά περιλαμβάνουν αλληλούχιση επιλεγμένων γονιδίων (πολυγονιδιακά πάνελ) που σχετίζονται με κάποια ασθένεια (Disease-targeted gene panels), αλληλούχιση των εξονίων όλων των γονιδίων του γονιδιώματος 100X με κλινική βιοπληροφορική ανάλυση  (Whole Exome Sequencing-WES 100 X) και αλληλούχιση όλου του γονιδιώματος 30Χ με κλινική βιοπληροφορική ανάλυση (Whole Genome Sequencing-WGS).

H αλληλούχιση των εξονίων όλων των γονιδίων του γονιδιώματος 100X (Whole Exome Sequencing-WES 100 X), αποτελεί την κοινότερη μέθοδο αυτή την στιγμή, παγκοσμίως. Με την ανάλυση αυτή, ελέγχονται τα κωδικοποιητικά μέρη του κάθε γονιδίου δηλαδή τα μέρη όπου παράγουν πρωτεϊνες και στα οποία συνήθως περιλαμβάνονται κατα το μεγαλύτερο ποσοστό μεταλλαγές που προκαλόυν νόσο. Επιπροσθέτως, η ανάλυση WES περιλαμβάνει ανάγνωση του DNA του κάθε ατόμου σε βάθος 100, δηλαδή διαβάζεται 100 φορές, κάνοντας την πιο αξιόπιστη.

Με τη μέθοδο αλληλούχισης DNA νέας γενεάς NGS, και συγκεκριμένα με την κλινική αλληλούχιση όλων των εξονίων του γονιδιώματος  (Whole Exome Sequencing, WES), είναι δυνατόν να μελετηθούν με ακρίβεια οι μεταλλάξεις σε γονίδια. Συγκεκριμένα, με τη μέθοδο αυτή έχουν ανακαλυφθεί πολλαπλές μεταλλαγές για την διάγωση νοσημάτων που δεν μπορούσαν να ανιχνευτούν με τις παραδοσιακές κυτταρογενετικές μεθόδους.  

WES – Κλινική Ανάλυση Γονιδιώματος 

Οι τεχνολογίες αλληλούχισης επόμενης γενιάς έχουν αλλάξει δραματικά το πεδίο της μοριακής διαγνωστικής. Η αλληλούχιση των εξονίων του γονιδιώματος (WES) έχει εξελίξει τη βιοϊατρική έρευνα επεκτείνοντας τα αποτελέσματα και τις εφαρμογές στην κλινική διάγνωση. Περίπου το 1% του ανθρώπινου γονιδιώµατος αποτελούν οι κωδικοποιούσες περιοχές µε το 85% των µεταλλάξεων που προκαλούν ασθένειες να βρίσκονται στις περιοχές αυτές και σε λειτουργικές περιοχές του γονιδιώµατος. Για το λόγω αυτό ο προσδιορισµός της πλήρης αλληλουχίας των εξονίων του γονιδιώµατος δίνει τη δυνατότητα να αποκαλυφθούν τα αίτια µεγάλου αριθµού σπάνιων και ως επί το πλείστον µονογονιδιακών γενετικών διαταραχών καθώς και προσδιορισµό γενετικής προδιάθεσης για καρκίνο. Μέσω του WES μπορεί κανείς να αποκαλύψει νέες παραλλαγές που δεν είναι γνωστό ότι σχετίζονται με κάποια νόσο ή προκαλούν εξαιρετικά σπάνιες ασθένειες και να ταυτοποίησει παθογόνες μεταλλαγές για ασθένειες οι οποίες δεν έχουν σχέση με το κύριο σκοπό της εξέτασης που ζητήθηκε (δευτερεύοντα ευρήματα). Επίσης, μπορεί να προσδιοριστεί η ύπαρξη φορείας για υπολειπόμενη νόσο, αλλά και φαρμακογενετικές παραλλαγές που μπορεί να επηρεάσουν την ανταπόκριση ενός ατόμου σε κάποιο φαρμακευτικό παράγοντα.

Η επιλογή των µελών της οικογένειας που θα αλληλουχηθούν και θα αναλυθούν επηρεάζεται από το µοτίβο κληρονοµικότητας για το συγκεκριµένο νόσηµα (επικρατές ή υπολειπόµενο) και αν άλλα µέλη της οικογένειας µε ή χωρίς παρόµοιο φαινότυπο είναι διαθέσιµα για ανάλυση. Σε µερικές περιπτώσεις µπορεί να είναι σηµαντικό να εξεταστούν µη προσβεβληµµένοι / υγιείς συγγενείς. Όταν υπάρχει υπόνοια για de novo μεταλλαγή προτιµάται να εξετάζονται οι βιολογικοί γονείς του ασθενούς και αν η μεταλλαγή δεν ανιχνεύεται σε κανέναν από τους δύο, χαρακτηρίζεται ως de novo. Όταν υπάρχει υπόνοια για επικρατή ή υπολειπόµενη κληρονοµικότητα, οι γονείς, τα αδέλφια ακόµα και µακρινοί συγγενείς µπορούν να εξεταστούν ανάλογα µε το οικογενειακό ιστορικό, έτσι ώστε να µειωθούν οι πιθανές υποψήφιες παραλλαγές. Έτσι, η αλληλούχηση σε δύο προσβεβληµένα ξαδέλφια θα δώσει λιγότερες υποψήφιες παραλλαγές σε σχέση µε την αλληλούχηση σε δύο προσβεβληµένα αδέλφια. Σε άλλες περιπτώσεις, αλληλούχηση επόµενης γενιάς µπορεί να γίνει µόνο στο προσβεβληµένο άτοµο.

Να σημειώσουμε εδώ ότι  με την πάροδο του χρόνου, οι μελέτες οικογενειών για την διάγνωση σπάνιων κληρονομούμενων νοσημάτων έχουν αρχίσει να υποχωρούν και να ελέγχονται μόνον οι ασθενείς. 

Ο κυριότερος λόγος είναι διότι έχουν αναπτυχθεί μέσα από την έρευνα, διεθνείς βάσεις δεδομένων και ΑΙ εργαλεία βιοπληροφορικής ανάλυσης, που μας ενημερώνουν για την παθογένεια των μεταλλάξεων χωρίς την αναγκαία ταυτοποίηση τους στους συγγενείς. Αυτό φυσικά αποφασίζεται κατά περίπτωση ασθενούς / νοσήματος.

Μιτοχονδριακό DNA – Πλήρης ανάλυση με NGS ή σημειακή αλληλούχιση με Sanger Sequencing

 Με τον υψηλό εξελικτικό ρυθμό και την απουσία ανασυνδιασμού, το μιτοχονδριακό DNA υπόκειται σε διαρκή γενετική διάβρωση λόγω μεταλλάξεων. Αν και είναι μικρό σε μέγεθος είναι υπεύθυνο για τη διασφάλιση της σωστής λειτουργίας των κυττάρων μας. Περιέχει 37 γονίδια που κωδικοποιούν 13 πρωτεΐνες, 22 μεταφορικά RNA και 2 ριβοσωμικά RNA. Οι 13 μιταχονδριακώς γονιδιακώς κωδικοποιημένες  πρωτεΐνες καθοδηγούν τα κύτταρα να παράγουν  πρωτεΐνικές υπομονάδες των συμπλεγμάτων ενζύμου του οξειδωτικού συστήματος φωσφορυλίωσης, το οποίο επιτρέπει στα μιτοχόνδριανα δρουν ως οι δυνάμεις των κυττάρων μας. Η ποικίλη φύση των μιτοχονδριακών ασθενειών υπογραμμίζει τους πολλούς ρόλους που παίζουν τα μιτοχόνδρια και το DNA τους όχι μόνο ως “εργοστάσια” παραγωγής ενέργειας αλλά και ως ρυθμιστές του ανοσοποιητικού συστήματος.

Τα μιτοχόνδρια συμμετέχουν σε μερικές από τις πιο ζωτικές λειτουργίες του ευκαρυωτικού κυττάρου

• παραγωγή ATP μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης
• ρύθμιση της πρόσληψης του ασβεστίου
• απόπτωση (απομάκρυνση κυττάρων που εμφανίζουν βλάβες)
• μεταβολισμό απαραίτητων συστατικών

Οι μιτοχονδριακές λειτουργίες και οι κυτταρικές λειτουργίες κατ’ επέκταση εξαρτώνται από τον σωστό συντονισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των προϊόντων των γονιδίων που προέρχονται από το πυρηνικό και μιτοχονριακό γονιδίωμα.

Επειδή τα μιτοχόνδρια ανευρίσκονται σε όλους τους ιστούς, τα σύνδρομα που σχετίζονται με μεταλλάξεις μιτοχονδριακού DNA μπορεί να επηρεάσουν κάθε σύστημα του σώματος, συμπεριλαμβανομένου:

• του οφθαλμού (οπτική ατροφία, μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια, καταρράκτης),
• της ακοής (νευροαισθητήρια κώφωση),
• των ορμονών (κοντό ανάστημα, σακχαρώδης διαβήτης, υποπαραθυρεοειδισμός),
• της καρδιάς (οικογενείς μυοκαρδιοπάθειες, μπλοκ αγωγιμότητας),
• του γαστρεντερικού σωλήνα (εξωκρινής δυσλειτουργία του παγκρέατος, εντερική ψευδο-απόφραξη, γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση),
• του νευρικού συστήματος (αναπτυξιακές και ψυχιατρικές διαταραχές, άνοια),
• του μυϊκού συστήματος (αδυναμία, υποτονία, επιληπτικές κρίσεις, μυϊκή πόνοι),
• του ήπατος (υπογλυκαιμία, ηπατική ανεπάρκεια) και
• των νεφρών (νεφρική σωληναριακή οξέωση, νεφρωσικό σύνδρομο).

Αναλόγως του φαινότυπου και του οικογενειακού ιστορικού, ο ειδικός αποφασίζει αν θα διεξαχθεί ανάλυση του ολόκληρου του μιτοχονδριακού DNA ( περίπου 1000 Χ μέσω NGS) ή στοχευμένη ανάλυση ενός γονιδίου στο μιτοχονδριακό DNA (Sanger Sequencing).